INTISARI ANALISIS ASAM AMINO DALAM CUMI-CUMI (TODARODES PASIFICUS)

A.   Pendahuluan

Protein

Protein merupakan zat makanan yang penting bagi tubuh, karena di samping sebagai sumber energi, juga merupakan zat pembangun tubuh, sehingga teknik biokimia untuk menentuan urutan dan komposisi asam amino dalam makanan yang banyak mengandung protein merupakan teknik yang perlu dikembangkan lebih lanjut.

Kebutuhan protein tubuh sekitar 1 g protein/kg berat badan per hari. Bila dua jenis protein yang memiliki asam amino essensial pembatas yang berbeda dikonsumsi bersama-sama, maka kekurangan asam amino dari satu protein dapat ditutupi oleh asam amino sejenis yang berlebihan pada protein yang lain, sehingga protein tersebut saling mendukung, karenanya perlu sekali pengetahuan mengenai gizi dan susunan asam amino makanan.

Telah banyak metode yang digunakan untuk menentukan urutan asam amino dari suatu protein. Metode manual dengan kromatografi kertas dan lapis tipis telah dikembangkan untuk memisahkan asam amino hasil hidrolisis protein dengan menggunakan sistem variasi

pelarut, namun metode ini memiliki pemisahan yang terbatas.

Metode lain yang cukup menjanjikan untuk analisis asam amino adalah dengan kromatografi gas-cair. Hanya sejumlah kecil asam amino yang dibutuhkan yaitu 10"n mol dan membutuhkan waktu yang singkat. Kesulitan yang sering timbul adalah bahwa asam amino merupakan senyawa yang non volatil. Kebanyakan asam amino akan terdekomposisi di bawah titik leburnya saat diinjeksikan pada alat. Berdasarkan hal itu maka asam amino perlu diderivatifkan terlebih dahulu untuk membentuk senyawa yang stabil terhadap panas dan cukup volatil

sehingga dapat dianalisis dengan kromatografi gas.

Metode terbaru dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ternyata dapat digunakan untuk menganalisis asam amino. Metode ini sangat sensitif dan merupakan metode analisis yang cepat, meskipun membutuhkan persiapan yang cukup mahal. Keuntungan penggunaan KCKT yang utama adalah tidak dibutuhkan derivat asam amino yang volatil, dan kemampuannya untuk memisahkan bentuk D dan L dari asam amino.

Masalah pertama dalam analisis asam amino adalah pemisahan dan sensitifitasnya. Beberapa protein asam amino mempunyai rantai samping dengan sifat fisik yang dapat langsung diketahui dalam larutan. Gugus-gugus utama seperti fenilalanin, tirosin, triptopan dapat dideteksi dengan detektor UV-Vis, fluorosens dan elekttokimia karena mempunyai gugus aromatik, tetapi secara umum asam amino mempunyai sedikit gugus kromofor sehingga untuk dapat dideteksi dengan detektor UVVis maka asam amino tersebut perlu diderivatifkan terlebih dahulu.

Pada penelitian ini dicoba untuk menganalisis komponen asam amino penyusun protein dalam cumi-cumi (Todarodes pacifiicus) yang hidup di air laut. Kandungan protein jenis ikan ini cukup tinggi sehingga menarik untuk dikaji lebih lanjut mengenai komponen asam-asam amino penyusunnya. Ikan air laut mempunyai kandungan protein dalam kisaran 8-21 % sedangkan ikan air tawar 13,5-17,3 %.4 Reagen penderivatif yang akan digunakan yaitu PITC dan untuk memisahkan asam amino hasil hidrolisis sampel digunakan KCKT dengan detektor UV-Vis.

Cumi-cumi (Todarodespasificus)

Cumi-cumi (Todarodes pasificus) yang biasa dikenal sebagai ikan mangsi termasuk golongan binatang lunak (mollusca), kelas cephalopoda yaitu menggunakan kepala sebagai alat untuk bergerak. Pada bagian kepala terdapat mulut yang dikelilingi oleh 10 tangan penangkap yang

mempunyai alat penghisap yang berbentuk bundat. Seluruh organ tubuhnya diselaputi oleh membran/mantel.

Karakteristik dari cumi-cumi adalah adanya kantung tinta yang terdapat di atas usus besar dan bermuara di dekat anus. Bila cumicumi diserang musuh, kantung tinta akan berkontraksi melalui pipa. Hal ini menyebabkan pembentukan awan hitam di sekililingnya yang memungkinkan cumi-cumi terhindar dari serangan musuh. Menurut Zaitsev, dkk, cumi-cumi mengandung 78,1-82,5 % air, 0,2-1,4% lemak, 14,8-18,8% protein dan 1,2-1,7 % abu, dan bagian yang dapat dimakan meliputi badan, kepala, dan tentakel.

            Gomez-Guillen, dkk membandingkan stiuktur dan sifat fisik dari ekstrak gelatin pads beberapa spesies ikan laut yang berbeda salah satunya adalah cumi-cumi. Analisis asam aminonya menggunakan alat analisis asam amino Beckman 6300 dan ternyata glisin mempunyai kandungan terbesar diikuti prolin dan arginin.

Kandungan protein dalam cumi-cumi memang cukup tinggi. Dalam 100 g daging cumi-cumi mengandung 15,3 g protein, 1,0 g lemak, 79,3 g air, 1,8 g abu, 3 g karbohidrat dan menghasilkan energi sebesar 89 kalori, sedangkan kolesterol tidak diternukan.

B.     Metodologi Penelitian

1.      Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah, Ktomatografi Cair Kinerja Tinggi merk PERKIN ELMER, LC-oven 101, Shimpack CLC-ODS (C-l 8), diameter 6 mm, panjang 15 cm, ukuran partikel 5 mm dan detektor UV-Vis, LC 295, PH Meter model HM-5B, Tokyo TOA Electronics Ltd, Japan, Kromatografi gas-Spektroskopi massa merk Shimadzu QP-5000, Micro Centrifuge, Charles Coffin, syringe ukuran 2-40 ml, seperangkat alat gelas merk Pyrex. Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Cumi-cumi (Todarodes pastficus), Etanol (E. Merck), tri etil amin (E.Merck), fenilisotiosianat (PITC) (E.Merck), asam klorida (E.Merck), natrium hidroksida (E.Merck), asetonitril (E.Merck), asam asetat (E. Merck), natrium asetat.3 H2O (E.Merck), aseton (E.Merck), asam amino mumi, akuabides.

2.      Prosedur Penelitian

Analisis asam amino standar dilakukan dengan menderivatisasi terlebih dahulu kedelapan asam-asam amino murni yaitu glutamat fenilalanin, histidin, prohn, arginin, leusin, valin dan treonin yang masing-masing dilarutkan dalam akuabides sehingga diperoleh larutan asam amino 0,01 M. Larutan asam amino dikeringkan vakum kemudian dilarutkan dalam pelarut etanol:air:trietilamin(TEA) = 2:2:1 (v/v).

Campuran larutan tersebut dikeringkan vakum lagi selama 15 menit, setelah itu ditambahkan etanol:TEA:air:PITC =7:1:1:1 (v/v) dan dikeringkan vakum selama 20 menit. Hasil derivatisasi tersebut dilarutkan dalam larutan buffer asetat 0,01 M pH 4,9 : asetonitril = 62:38 (v/v). Terhadap 3 asam amino yang pertama yaitu glutamat, fenilalanin dan histidin dilakukan pemanasan saat pengeringan vakum hingga suhu 50 °C.

Asam-asam amino murni yang telah diderivatisasi dianalisis dengan KCKT. Kondisi KCKT yang digunakan dalam analisis ini yaitu menggunakan kolom CIS, suhu kolom pada suhu kamar, laju alir eluen 1 ml/menit dan detektor yang digunakan yaitu detektor UV-Vis pada 1 254 nm. Sebagai eluen A yaitu larutan buffer asetat pH 4,9 : asetonitril = 47:3 (v/v) dan eluen B yaitu asetonitril: air = 60 :40 (v/v) dengan program gradien sebagai berikut:

Sampel cumi-cumi dibuat tepung terlebih dahulu kemudian dihidrolisis dengan asam klorida dalam oven hingga suhu 110 °C selama 24 jam. Hasil hidrolisis sampel disentrifugasi kemudian filtratnya dipisahkan. Filtrat dikeringkan vakum kemudian dilarutkan dalam etanol:air:TEA = 2:2:1 (v/v). Larutan ini dikeringkan vakum lagi selama 15 menit kemudian ditambahkan etanol:TEA:air:PITC = 7:1:1:1 (v/v). Hasil reaksi derivatisasi ini kemudian dikeringkan vakum lagi sekma 20 menit kemudian dilarutkan dalam pelarut buffer asetat pH 4,9 : asetonitril = 62:38 (v/v). Sampel hasil derivatisasi diinjeksikan ke dalam alat KCKT dengan kondisi yang sama dengan analisis asam amino standar.

C.   Hasil Penelitian dan Pembahasan

1.  Analisis Asam Amino Standar

Pada penelitian ini, sebagai zat penderivarif digunakan senyawa PITC dan untuk mengetahui keberhasilan derivatisasi menggunakan senyawa tersebut, mula-mula derivatisasi dilakukan terhadap 3 asam amino murni yaitu glutamat, fenilalanin dan histidin. Selama proses derivatisasi, ketiga asam amino murni tersebut dipanaskan sampai suhu 50 °C, karena ingin diketahui apakah asam amino rusak dengan adanya pemanasan. Kromatogram yang diperoleh yaitu untuk histidin diperoleh 2 puncak yaitu pada waktu retensi 9,5 dan 12,7 menit. Kromatogram fenilalanin diperoleh 1 puncak pada waktu retensi 15,5 menit, sedangkan untuk glutamat diperoleh 3 puncak yaitu pada waktu retensi 2,49 , 3,11 dan 22,4 menit. Diduga munculnya puncak-puncak yang lebih dari satu ada beberapa kemungkinan diantaranya asam amino rusak dengan adanya pemanasan (saat pengeringan vakum), untuk fenilalanin hanya diperoleh 1 puncak, hal ini karena fenilalanin relatif stabil dengan pemanasan. Proses derivatisasi diulangi dan tidak dilakukan pemanasan. Kromatogram yang diperoleh cukup bagus yaitu glutamat muncul pada waktu retensi 9,978 menit, fenilalanin muncul pada waktu retensi 14,947 menit dan histidin muncul pada 2,427 menit. Berdasarkan kromatogram dari masing-masing asam amino, selalu diperoleh 2 puncak kromatogram dan salah satu puncak selalu muncul pada waktu retensi sekitar 32 menit. Diduga puncak yang muncul pada waktu retensi tersebut adalah zat penderivatif yang tidak ikut bereaksi/ berlebih. Hal ini diperkua-1 dengan kromatogram yang diperoleh sant diinjeksikan larutan PITC murni dan ternyata muncul puncak yang sangat lebar dan tinggi pada waktu retensi sekitar 32 menit tersebut dan untuk memperbanyak kromatogram standar dalam analisis asam amino pada sampel, maka dengan prosedur yang satna derivatisasi dilakukan terhadap 5 asam amino murni yang lain yaitu prolin, arginin, leusin, valin dan treonin. Hasil analisis dengan KCKT dari kelima asam amino murni tersebut juga memberikan kromatogram yang cukup bagus yaitu untuk arginin diperoleh puncak kromatogram pada waktu retensi 2,648 menit, prolin muncul pada waktu retensi 2,58 menit, leusin pada waktu retensi 15,727 menit, valin muncul pada waktu retensi 10,662 menit dan treonin muncul pada waktu retensi 2,013 menit.

Tabel 2

Tinggi Puncak Ktomatogram dan Waktu Retensi PITC-Asam Amino Murni

No	Asam Aino	Waktu Retensi (menit)	Luas Area (%)
1	Histidin	2,43	13,20
2	Fenilalanin	14,95	18,34
3	Arginin	2,65	12,04
4	Leusin	15,73	7,12
5	Prolin	2,58	41,46
6	Valin	10,66	13,98
7	Glutamat	9,98	88,29
8	Treonin	2,01	7,90

2. Derivatisasi Asam Amino

Tujuan utama dari proses derivatisasi asam amino adalah diperolehnya suatu senyawa baru yang mempunyai gugus kromofor sehingga diharapkan dapat menaikkan sensitivitas deteksi dengan demikian senyawa baru tersebut dapat terdeteksi dengan detektor UV-Vis.

Reaksi yang terjadi pada derivatisasi asam amino adalah reaksi adisi nukleofilik yaitu gugus NH2 dari asam amino menyerang atom C dari PITC, terjadi siklisasi menghasilkan suatu derivat N-feniltiourea, kemudian dengan lepasnya air maka akan terbentuk derivat phenylthiohydantoin

(PTH). PTH-asam amino imlah yang dapat diidenrifikasi secara kromatografi. Waktu retensi dari derivat PTH-asam amino ini kemudian dibandingkan dengan waktu retensi dari Soam amino standar

yang ada, sehingga asam amino dalam sampel dapat diketahui.

Secara umum mekanisme dari reaksi derivatisasi asam amino tersebut adalah sebagai berikut:

R adalah rantai samping dari asam amino dan asatn-asam amino yang digunakan dalam penelitian ini adalah glutamat, histidin, fenilalanin, leusin, prolin, treonin, valin dan arginin.

Mekanisme derivatisasi untuk asam amino glutamat terlihat pada gambar berikut:

Derivatisasi dari ketujuh asam amino yang digunakan sebagai standar juga mengalami siklisasi membentuk PTH-asam amino seperti halnya asam amino glutamat.

3. Analisis Asam Amino Sampel Cumi-cumi

Filtrat sampel cumi-cumi hasil hidrolisis yang telah diderivatifkan, dilarutkan dalam 100 ml larutan buffer asetat 0,01 M pH 4,9: asetonitril = 62:38 (v/v). Sebanyak 20 ml sampel diinjeksikan ke dalam alat KCKT dengan detektor UV-Vis pada panjang gelombang 254 nm. Kondisi dan prosedur analisis sampel sama dengan kondisi dan prosedur analisis asam amino murni yang digunakan sebagai standar.

Berdasarkan kromatogram yang diperoleh, terlihat bahwa puncakpuncak kromatogram juga memisah cukup bagus, meskipun masih terlihat pula beberapa puncak-puncak kecil yang dianggap sebagai pengotor. Selain itu puncak kromatogram dari PITC yang berlebih juga masih muncul pada waktu retensi sekitar 32 menit dengan demikian terdapat 8 puncak kromatogram yang dianggap dominan seperti terlihat dalam tabel berikut:

Tabel 3

Waktu Retensi, Tinggi Puncak dan Luas Area dari Kromatogram Sampel Cumi-cumi

No	Waktu Retensi (menit)	Tinggi Puncak (cm)	Luas Area (%)
1	2,79	17,5	10,29
2	3,10	17,3	14,39
3	3,31	17,2	15,83
4	11,05	2,2	2,24
5	12,34	3,0	4,02
6	13,71	9,1	11,89
7	16,16	16,2	21,95
8	17,19	17,0	19,41

Waktu retensi dari kromatogram yang diperoleh dalam sampel cumi-cumi dibandingkan dengan waktu retensi dari kromatogram asam amino standar yang dimiliki dan dari 8 puncak kromatogram tersebut, hanya 4 puncak kromatogram yang dapat teranalisis yaitu puncak pada waktu retensi 2,783; 3,1; 3,31 dan 16,158 menit, seperti terlihat dalam tabel berikut:

Tabel 4

Komponen Asam Amino dalam Sampel Cumi-cumi setelah Dibandingkan dengan Kromatogram Asam Amino Standar

No	Waktu Retensi (menit)	Prediksi Asam Amino
1	2,79	Histidin
2	3,10	Prolin
3	3,31	Arginin
4	16,16	Leusin

Berdasarkan kromatogram sampel cumi-cumi di atas terlihat bahwa luas area terbesar adalah pada waktu retensi 16,16 menit yang rnerupakan puncak kromatogram dari leusin. Hal ini berarti kandungan leusin dalam cumi-cumi cukup tinggi, sedangkan ketiga asam amino yang lain yaitu histidin, arginin, dan prolin dapat pula dikatakan berada dalam jumlah yang cukup besar, terlihat dari tingginya puncak yang dihasilkan.

Penelitian-penelitian sebelumnya seperti yang dilakukan oleh Konusu dalam Borgstrom (1965) juga menunjukkan bahwa komponen asam amino penyusun protein dalam cumi-cumi, mempunyai kandungan prolin yang terbesar (67,3 mg %), diikuti histidin, arginin, gliski dan alanin.

Leusin, arginin dan histidin termasuk dalam golongan asam amino essensial yang sangat diperlukan oleh tubuh sedangkan prolin termasuk dalam asam amino non essensial.

D.   Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan yang telah dilakukan, maka dapat ditarik beberapa kesimpulan:

1. Hidrolisis protein tnenggunakan HC1 6 M selama 24 jam pada 110 °C dapat menghasilkan 8 asam amino dalam sampel cumi-cumi.

2. PITC dapat digunakan sebagai zat penderivatif dalam menganalisis asam amino menghasilkan suatu senyawa PTH-asam amino yang dapat menyerap cahaya pada daerah UV-Vis, 1 = 254 nm.

3. Metode KCKT dengan teknik elusi gradien dapat digunakan untuk memisahkan asam-asam amino penyusun suatu protein.

4. Hasil pemisahan asam amino yang dapat teranalisis untuk sampel cumi-cumi yaitu histidin, arginin, prolin dan leusin.

E.    Penutup

Analisis komponen asam amino penyususun protein dalam cumi-cumi yang hidup di air laut dapat dilakukan melalui tahapan analisis asam amino standar (berdasarkan tinggi puncak kromatogram dan waktu retensi PITC-asam amino murni), derivatisasi asam amino (berdasarkan perbandingan waktu retensi dari derivat PTH-asam amino dengan waktu retensi dari asam amino standar yang ada) dan analisis asam amino cumi-cumi (berdasarkan perbandingan waktu retensi, tinggi puncak dan luas area dari kromatogram sampel cumi-cumi dengan kromatogram asam amino standar sehingga asam amino dapat diprediksi).

Daftar Pustaka

Chandrashekar, K., and Y.G. Deosthale, "ProximateComposition, Amino Acids, Mineral and Trace Element Content of the Edible

Muscle of 20 Indian Fish Species," J. Food Comp. Anal., 6, 1993:195-200.

Crippen, R.C., GC/L.C, Instruments, Derivatives in Identifying Pollutants and   Unknowns, New York: Pergamon Press, Inc, 1983.

Croft, L.R., Introduction to Protein Sequence Analysis, New York: John Wiley & Sons, Ltd, 1980.

Gomez-Guillen, M.C., J. Turnay, M.D. Fernandez-Diaz, N. Ulmo, M.A. Lizarbe, P. Montero, "Structural and Physical Properties of Gelatin Extracted from Different Marine Species: A Comparative Study/' Food HydrocoL, 16, 2002: 25-34.

Poerwadi, Rosmawaty, PA., Penelitian Mikrobiologi Cumi-cumi selama Penyimpanan Dingin dan Bekif, Laporan Penehtian Teknologi

Perikanan, 1984.

Winarno, EG., 1991, Kimia Pangan & Gi%i, Jakarta: Gramcdia Pustaka Utama, 1991.

Zaitsev, V, I. Kizevetter, L. Lagunov, T. Makarova, L. Minder, and V. Pasevalod, 1969, Fish Curing and Processing, trans. A.DE Kerindol, Moscow: MIR Publishers, 1969.